测定土壤过氧化氢酶活性常用测定方法及操作要点

　　测定土壤过氧化氢酶活性是评估土壤氧化还原能力和微生物代谢活动的重要指标。过氧化氢酶能催化过氧化氢(H₂O₂)分解为水和氧气，其活性反映土壤对毒性物质的解毒能力。以下是常用测定方法及操作要点：

　　一、常用测定方法

　　1. 滴定法(KMnO₄法)

　　原理：

　　通过测定未被过氧化氢酶分解的剩余H₂O₂量，间接计算酶活性。H₂O₂在酸性条件下与高锰酸钾(KMnO₄)反应，滴定至终点(粉红色消失)。

　　步骤：

　　样品处理：取5g新鲜土壤，加入40mL去离子水和5mL 3% H₂O₂溶液，25℃振荡培养20分钟;

　　终止反应：加入10mL 3.6M H₂SO₄终止反应;

　　过滤：用无灰滤纸过滤，取滤液;

　　滴定：取10mL滤液，逐滴加入0.02M KMnO₄至粉红色持续30秒不褪;

　　计算：根据空白与样品消耗KMnO₄体积差计算H₂O₂分解量。

　　公式：

　　(V0​：空白滴定体积;V：样品滴定体积;CKMnO₄​：KMnO₄浓度;W：土壤干重;t：反应时间，单位h;17为H₂O₂摩尔质量与反应系数乘积)

　　优点：无需复杂仪器，成本低;

　　缺点：操作繁琐，终点判断需经验。

　　2. 比色法(硫酸钛法)

　　原理：

　　剩余H₂O₂与硫酸钛(Ti(SO₄)₂)生成黄色络合物，通过分光光度计测定吸光度(OD值)。

　　步骤：

　　反应体系：土壤悬液与H₂O₂混合培养(同滴定法);

　　显色：加入硫酸钛试剂，400nm波长测OD值;

　　标准曲线：用已知浓度H₂O₂溶液绘制标准曲线，计算剩余H₂O₂量。

　　优点：灵敏度高，适合批量样品;

　　缺点：需分光光度计，试剂需避光保存。

　　3. 气体体积法

　　原理：

　　通过测量H₂O₂分解产生的氧气体积，直接反映酶活性(需密闭装置连接气体收集管)。

　　适用场景：实验室快速动态监测;

　　优点：实时性强;

　　缺点：设备要求高，操作复杂。

　　二、样品处理与实验关键点

　　1. 样品采集与保存

　　采集新鲜土壤(0-20cm表层土)，剔除根系和杂质;

　　立即测定或4℃短期保存(避免冷冻或风干导致酶失活)。

　　2. 反应条件控制

　　温度：25℃恒温培养(温度敏感，±1℃误差需校准);

　　pH：反应体系pH接近中性(H₂O₂分解速率受pH影响);

　　时间：培养时间20~30分钟(过长可能因H₂O₂耗尽导致非线性反应)。

　　3. 干扰排除

　　土壤中Fe²⁺、Mn²⁺等还原性物质会干扰H₂O₂稳定性，需通过预实验评估;

　　加入缓冲液(如磷酸盐缓冲液)维持反应体系pH稳定。

　　三、数据计算与单位

　　酶活性单位：

　　常用单位：mL 0.02M KMnO₄/(g·h) 或 μmol H₂O₂/(g·h);

　　换算关系：1mL 0.02M KMnO₄ ≈ 0.17mg H₂O₂。

　　示例计算(滴定法)：

　　空白滴定体积 V_0 = 5.0\text{mL}V0​=5.0mL，样品体积 V = 3.5\text{mL}V=3.5mL，土壤干重 W = 5\text{g}W=5g，反应时间 t = 0.33\text{h}t=0.33h：

　　四、注意事项

　　试剂配制：

　　H₂O₂溶液需现用现配(易分解);

　　硫酸钛试剂避光保存(遇光易氧化)。

　　质量控制：

　　每组实验设置空白对照(不加土壤或灭活土壤);

　　标准曲线需覆盖样品浓度范围(R² > 0.99)。

　　安全防护：

　　H₂O₂具有腐蚀性，避免接触皮肤;

　　浓硫酸操作时戴防护手套和护目镜。

　　五、参考标准与文献

　　国家标准：

　　《土壤检测 第15部分：土壤酶活性的测定》(NY/T 1121.15-2006);

　　学术方法：

　　Johnson, J.L. & Temple, K.L. (1964). Soil Science;

　　《土壤农业化学分析方法》(鲁如坤主编)。

来源：网络