郑州土壤检测机构：土壤纤维素酶活性测定方法

　　土壤纤维素酶活性的标准测定方法(DNS比色法)，包含详细步骤、注意事项及数据解读，适用于科研与环境监测：

　　一、方法原理

　　纤维素酶催化羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水解生成还原糖(葡萄糖)，在碱性条件下与**3,5-二硝基水杨酸(DNS)**反应生成棕红色化合物，通过分光光度法(540 nm)定量测定酶活性。

　　二、实验准备

　　1. 试剂配制

　　2. 仪器设备

　　分光光度计(540 nm)

　　恒温水浴振荡器(50±0.5℃)

　　离心机(≥4000 rpm)

　　pH计、分析天平

　　三、操作步骤

　　1. 样品处理

　　新鲜土样：过2 mm筛，按 土:缓冲液=1:5(w/v) 悬浮于pH 5.5醋酸缓冲液，4℃离心(4000 rpm, 10 min)，上清液为粗酶液。

　　干土：需预先复湿(25℃培养24 h)。

　　2. 酶反应体系

　　反应条件：50℃水浴振荡(120 rpm)1 h，立即冰浴终止。

　　3. 显色与测定

　　取1 mL反应液 + 1 mL DNS试剂，沸水浴5 min(显色完全)。

　　冷却后定容至10 mL，离心(4000 rpm, 5 min)。

　　上清液于540 nm测吸光度(A₅₄₀)，对照调零。

　　4. 标准曲线 

　　四、计算与数据表达

　　1. 酶活性计算

　　纤维素酶活性(μg

       C：标准曲线计算的葡萄糖浓度(μg/mL)

　　VV：反应总体积(3 mL)

　　DD：稀释倍数(若显色后定容)

　　mm：土壤干重(g)

　　tt：反应时间(h)

　　2. 单位换算

　　国际单位(IU)：1 μmol葡萄糖/min·g = 18 μg/min·g

　　示例：测得50 μg葡萄糖/g·h ≈ 0.046 IU/g

　　五、关键注意事项

　　pH控制：醋酸缓冲液严格调至pH 5.5(纤维素酶z适pH)。

　　温度稳定性：水浴温度偏差≤±0.5℃，避免酶失活。

　　干扰排除：

　　土壤本底糖：设置无底物对照组扣除。

　　腐殖酸干扰：高有机质土壤可用活性炭吸附(1% w/v)。

　　数据报告：

　　注明以干重计(105℃烘干至恒重)。

　　标注培养条件(如好氧/厌氧)。

　　六、方法优化(特殊土壤)

　　七、方法对比与选择

　　推荐流程：

　　常规监测：DNS比色法(参考ISO 20130)。

　　高精度需求：结合HPLC验证(如EPA 8321)。

　　特殊土壤：先超声/透析预处理，再DNS测定。

　　示例数据：健康农田土壤纤维素酶活性通常为 30-100 μg葡萄糖/g·h，污染或退化土壤可能低于20 μg/g·h。

来源：网络