郑州土壤检测机构：土壤β葡糖苷酶活性测定方法

　　土壤β-葡糖苷酶(β-glucosidase)活性测定常用比色法，以人工合成底物 对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物，在适宜条件下被酶水解生成黄色的对硝基苯酚(pNP)，通过分光光度计测定其吸光度，从而计算酶活性。该方法操作简便、灵敏度高，是国际通用的标准方法之一。

　　1. 样品准备：

　　称取相当于1.0 g烘干土的新鲜土壤样品(精确到0.01g)于50mL三角瓶或离心管中。同时设置以下对照：

　　样品处理(3个重复)： 土壤 + 底物缓冲液 → 测定酶活性。

　　土壤对照(3个重复)： 土壤 + 等体积纯缓冲液(无底物) → 扣除土壤本身颜色或能释放PNP的物质。

　　基质对照： 无土壤，只有底物缓冲液 → 检查底物自身是否分解。

　　2. 酶促反应：

　　向样品处理组加入4 mL 0.05 M PNG缓冲液。

　　向土壤对照组加入4 mL 纯缓冲液。

　　将所有样品充分混匀后，塞紧瓶塞。

　　置于37℃恒温培养箱中，精确培养1小时。期间可间歇轻摇或置于振荡培养箱中。

　　3. 反应终止与显色：

　　培养结束后，立即向每个样品中加入 1 mL 0.5 M CaCl₂溶液 和 4 mL 0.5 M Tris-HCl缓冲液(pH 8)，充分混匀以终止反应并创造碱性显色环境。

　　将反应液全部转移至离心管，在4℃下以约4000 rpm离心5分钟，获取上清液。

　　4. 比色测定：

　　将上清液小心倒入比色皿中。

　　用分光光度计在405 nm波长下测定其吸光度值(OD₄₀₅)。

　　以土壤对照组的平均吸光度值作为空白调零，读取样品处理组的吸光度值。

　　5. 标准曲线绘制：

　　用PNP标准溶液系列，加入与样品等量的终止/显色剂(1 mL CaCl₂ + 4 mL Tris)，在405 nm下测定吸光度。

　　以PNP浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程(y = ax + b)。

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