酶联免疫吸附法标准操作流程

　　酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)是一种高灵敏度、高特异性的免疫学检测技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断、药物开发、食品安全和环境监测等领域。其核心原理是利用抗原-抗体特异性结合，并通过酶标记的二抗或抗原催化底物显色，实现对目标分子(如蛋白质、激素、病毒、抗体等)的定性或定量分析。

　　(1)包被(Coating)

　　将捕获抗体稀释于包被缓冲液(如碳酸盐缓冲液 pH 9.6);

　　加入 96 孔板(50–100 μL/孔)，4°C 过夜 或 37°C 2 h;

　　目的：抗体通过疏水作用吸附到孔壁。

　　(2)封闭(Blocking)

　　弃去包被液，每孔加 200 μL 封闭液(5% BSA 或脱脂奶粉 in PBST);

　　37°C 孵育 1–2 h;

　　目的：封闭未结合位点，减少非特异吸附。

　　(3)加样(Sample Incubation)

　　加入标准品(梯度稀释)和待测样本(血清、细胞上清等);

　　37°C 孵育 1–2 h;

　　洗板 3–5 次(PBST)。

　　(4)加检测抗体(Detection Antibody)

　　加入生物素化或酶标检测抗体;

　　37°C 孵育 1 h;

　　洗板。

　　若使用生物素-亲和素系统(如 HRP-Streptavidin)，需额外一步孵育。

　　(5)显色(Substrate Reaction)

　　加入 HRP 底物(如 TMB)或 AP 底物(如 pNPP);

　　室温避光反应 10–30 min;

　　HRP/TMB：蓝色 → 加终止液(2M H₂SO₄)变黄色，测 OD₄₅₀ nm;

　　AP/pNPP：黄色，测 OD₄₀₅ nm。

　　(6)读数与分析

　　用酶标仪读取 OD 值;

　　绘制 标准曲线(Log[浓度] vs OD);

　　计算样本浓度(软件自动拟合，常用 4-PL 或 5-PL 回归)。

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